PCR的问题最近在扩一段果蝇基因,得用CDNA做模板大概2K,60度以下扩不出来,60度以上扩出来的全是杂带.总之大家能想到的都试过,咋回事呢?那段基因引物是不是很好设,能用的都用了,26个碱基
来源:学生作业帮助网 编辑:作业帮 时间:2024/06/20 13:54:58
![PCR的问题最近在扩一段果蝇基因,得用CDNA做模板大概2K,60度以下扩不出来,60度以上扩出来的全是杂带.总之大家能想到的都试过,咋回事呢?那段基因引物是不是很好设,能用的都用了,26个碱基](/uploads/image/z/8487208-64-8.jpg?t=PCR%E7%9A%84%E9%97%AE%E9%A2%98%E6%9C%80%E8%BF%91%E5%9C%A8%E6%89%A9%E4%B8%80%E6%AE%B5%E6%9E%9C%E8%9D%87%E5%9F%BA%E5%9B%A0%2C%E5%BE%97%E7%94%A8CDNA%E5%81%9A%E6%A8%A1%E6%9D%BF%E5%A4%A7%E6%A6%822K%2C60%E5%BA%A6%E4%BB%A5%E4%B8%8B%E6%89%A9%E4%B8%8D%E5%87%BA%E6%9D%A5%2C60%E5%BA%A6%E4%BB%A5%E4%B8%8A%E6%89%A9%E5%87%BA%E6%9D%A5%E7%9A%84%E5%85%A8%E6%98%AF%E6%9D%82%E5%B8%A6.%E6%80%BB%E4%B9%8B%E5%A4%A7%E5%AE%B6%E8%83%BD%E6%83%B3%E5%88%B0%E7%9A%84%E9%83%BD%E8%AF%95%E8%BF%87%2C%E5%92%8B%E5%9B%9E%E4%BA%8B%E5%91%A2%3F%E9%82%A3%E6%AE%B5%E5%9F%BA%E5%9B%A0%E5%BC%95%E7%89%A9%E6%98%AF%E4%B8%8D%E6%98%AF%E5%BE%88%E5%A5%BD%E8%AE%BE%EF%BC%8C%E8%83%BD%E7%94%A8%E7%9A%84%E9%83%BD%E7%94%A8%E4%BA%86%EF%BC%8C26%E4%B8%AA%E7%A2%B1%E5%9F%BA)
PCR的问题最近在扩一段果蝇基因,得用CDNA做模板大概2K,60度以下扩不出来,60度以上扩出来的全是杂带.总之大家能想到的都试过,咋回事呢?那段基因引物是不是很好设,能用的都用了,26个碱基
PCR的问题
最近在扩一段果蝇基因,得用CDNA做模板大概2K,60度以下扩不出来,60度以上扩出来的全是杂带.总之大家能想到的都试过,咋回事呢?
那段基因引物是不是很好设,能用的都用了,26个碱基的引物,扩基因组能扩出来。克隆的基因确实是低丰度表达的。55度都扩不出来,高温的扩出来都是杂带。以前用别人的CDNA跟用我刚P的CDNA结果是一样的,据说用CDNA扩2K的片段很难。
PCR的问题最近在扩一段果蝇基因,得用CDNA做模板大概2K,60度以下扩不出来,60度以上扩出来的全是杂带.总之大家能想到的都试过,咋回事呢?那段基因引物是不是很好设,能用的都用了,26个碱基
1、跑个胶看RNA质量及有无降解,杜绝RNase的污染.
2、引物适合吗?
3、克隆的基因是低丰度表达的吗?如果是,扩增起来不是很顺利的.
4、上面都没问题的话,试着降低退火温度看看.
你参考一下,这里有RT-PCR常见问题与分析:
嗯.我是这么认为的,实验的引物、反应条件和反应体系都好解决.检测cDNA模板质量是关键.像目的基因的丰度(找到该目的片段丰度比较高的细胞来进行PCR,会有较好的效果),片段长度(长片段逆转录时逆转录酶的效率不高,建议分段扩增),RNA酶是否存在,都会影响cDNA模板质量.在保证cDNA模板质量前提下,建议从比较低的温度开始,待扩出目的片断后,再适当提高退火温度减少非特异带.别看我很懂得样子,实际做起来就是很辛苦.
引物特异性不高?
qq里说好了。
来个touch down看看,或者不要盲目的换退火温度,做个温度梯度看看
实在不行的话建议切胶回收