医药学论文：肿瘤细胞多药耐药基因及产物p糖蛋白检测方法的研究进展[1]

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　　摘要: 肿瘤细胞对化疗药物的多药耐药（MDR）是目前肿瘤病人化疗失败的主要原因。肿瘤细胞的多药耐药有多种类型。本文对Mdr1基因及P糖蛋白（pgp）的生物学特性及检测方法作一综述。

　　目前，化疗仍然是治疗恶性肿瘤的重要手段，尽管化疗方案的改进及新药的使用，临床化疗效果越来越好，但仍然发现一些患者在化疗前后对某些药物产生耐药性，从而影响化疗效果。研究发现，导致肿瘤化疗失败的原因之一是肿瘤对化疗药物的多药耐药。多药耐药是指由一种药物诱发，对该药耐药的同时，对其结构和作用机制无关的化疗药物产生交叉耐药。多药耐药的类型有多种。如Mdr1及其产物pgp的表达增高，多药耐药相关蛋白基因的扩增或表达增加，DNA拓朴异构酶Ⅱ活性增高或性质发生改变，谷胱甘肽解毒系统酶活性增高等。本文就Mdr1和pgp的生物学特性及检测方法作一综述。

　　1 多药耐药基因1（Mdr1）和P糖蛋白（pgp）的生物学特性

　　1.1 Mdr1 MDR基因在人类有二种Mdr1和Mdr2，其中Mdr1与肿瘤的多药耐药有关。Mdr2的功能尚不清楚，但Mdr1和Mdr2基因序列具有较高的同源性。人类Mdr1基因位于第7号染色体长臂上，含有28个外显子，内含子与外显子交界符合经典的A/G规则，全长为4.5Kb，含有一个开放读框，编码1280个氨基酸多肽，经糖基化后形成170KD的pgp[1]。目前对Mdr1基因的表达调控还处于研究之中。研究表明抗肿瘤药物、致癌剂、紫外线、热应激等都可使Mdr1基因活化，ras、raf、p53等癌基因也参与Mdr1基因的表达调控[2，3]。有人发现，在原发性乳腺癌患者中，Mdr1基因的转录受Y盒转录因子（YB-1）的调节，而且YB-1的位置与Mdr1基因表达密切相关，在对药物敏感的乳腺癌细胞株MCF-7中，YB-1位于胞浆中，而在耐药细胞株MCF-7中，YB-1位于细胞核中，因此认为YB-1也参与Mdr1基因的调控[4]。

　　1.2 pgp pgp是由Mdr1基因编码、其分子量为170KD、由1280个氨基酸组成的跨膜糖蛋白，由两个同源部分组成，两部分之间的同源性大约为48%，每一部分约含有6个疏水跨膜区和一个ATP结合位点，通过ATP供给能量，将亲脂性药物泵出细胞外。在正常人体的肾上腺、肾、肝、结肠、胰及脑毛细血管内皮细胞中均有Mdr1 pgp的表达，其生理功能为将细胞内的毒性代谢产物泵出细胞，对组织细胞起保护作用。在脑组织中，Mdr1 pgp对维持血脑屏障起重要作用，它可将内皮细胞中的异物（物药、致癌物等）排列毛细血管腔而保护脑组织。在正常人体的造血干细胞，T、B淋巴细胞，NK细胞上都有pgp表达，其生理功能仍不清楚，但研究表明pgp参与人体外周血T淋巴细胞中的细胞因子（如IL-2，IL-4，α-IFN）的输送[5，6]。Mdr1被克隆并发现在某些正常组织中表达后，人们就开始对肿瘤组织中的Mdr1进行分析。在肿瘤细胞中，pgp通过ATP供能，将长春新碱、秋水仙素、放线菌素D等药物泵出细胞外，导致肿瘤细胞耐药。

　　2 Mdr1和pgp的检测方法

　　Mdr1和pgp的检测方法主要有两类，一类是蛋白质定法，包括免疫组化法、免疫印迹法和流式细胞仪检测法等。一类是mRNA测定法，包括Northen blot、Slot blot、RNA原位杂交法及RT-PCR检测法。

　　2.1 免疫组化法 常用的方法是免疫组化ABC法。冰冻切片常规处理后，与抗pgp的单克隆抗体孵育，然后加入生物素标记的二抗孵育，再加亲合素-过氧化酶复合物孵育、洗片，最后用含0.03%-0.05%过氧化氢的DAB液显色分析结果。免疫组化法是较传统的检测方法，由于其操作简便，不需要贵重仪器，且可分析肿瘤细胞的异质性，因此是目前国内外常用的检测方法。由于其特异性和敏感性较低，且需要冰冻组织切片，因此1994年karoly等对此方法进行了改进，创建了一种新的“免疫组织化学夹心染色法（LPS）”，此方法直接用福尔马林固定的组织细胞，经石腊包理、切片、过氧化氢处理后，与抗pgp的单克隆抗体JSB-1孵育后有序地加三层过氧化物酶标记的第二抗体[第一层为过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG f(ab’)2，第二层为鼠单克隆过氧化酶 抗过氧化酶复合物，第三层为过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG f(ab’)2]的孵育、洗片、染色、分析结果。

　　LPS法直接取组织细胞固定，不需使用冰冻切片，且因增加了三层过氧化物酶标记的第二抗体，使免疫染色密度增加，结果更清晰。由于JSB-1抗医药学论文